| 24018683 25600 5883 938 1ания препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). К ним относятся мн. минералы, зёрна в шлифах сплавов, нек-рые животные и растит, ткани и пр. Оптич. свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях (см. Оптическая анизотропия) и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно вести как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор; сообщённая ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него), и эти изменения изучаются с помощью анализатора (см. Поляризационные приборы) и различных компенсаторов оптических. По таким изменениям можно судить об осн. оптич, характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптич. осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.
Метод фазового контраста (и его разновидность - т. н. метод "аноптрального" контраста) служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, напр., живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью спец. оптич. устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости ("амплитудный рельеф"), к-рые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствит. слое. Др. словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение наз. фазово-контрастным. В типичной для этого метода схеме (рис. 5) в переднем фокусе конденсора 3 устанавливается апертурная диафрагма 2, отверстие к-рой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива 5, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка 6, на поверхности к-рой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, наз. фазовым кольцом. Фазовая пластинка может быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае неотклонённые в препарате 4 лучи от осветителя f, дающие изображение диафрагмы 2, должны полностью проходить через фазовое кольцо, к-рое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на лямбда/4 (лямбда - длина волны света). В то же время лучи, даже ненамного отклонённые (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо (штриховые линии), и не претерпевают дополнит, сдвига фазы. С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклонёнными и неотклонёнными лучами оказывается близкой к 0 или лямбда/2, и в результате интерференции света в плоскости изображения 4' препарата 4 они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата. Отклонённые лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклонёнными, поэтому ослабление осн. пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклонёнными через фазовое кольцо. Для подобных частиц азово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.
Рис. 5.
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч, входящий в М., раздваивается; один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, а второй - мимо неё по той же или дополнит, оптич. ветви М. В окулярной части М. оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей 8, к-рая выражается формулой 8 = N * лямбда = = (п0 - nm)d, где п0 , пт - показатели преломления частицы и окружающей среды, d - толщина частицы, N - т. н. порядок интерференции, лямбда - длина волны света. Принципиальная схема одного из способов осуществления интерференционного контраста показана на рис. 6. Конденсор 1и объектив 4 снабжены двоя-копреломляющими пластинками (помечены на рис. диагональными стрелками), первая из к-рых расщепляет исходный световой луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект 3, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом); величина этого запаздывания измеряется компенсатором 5. Метод интерференционного контраста в нек-рых отношениях сходен с методом фазового контраста - оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод позволяет наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток (и часто применяются именно с этой целью). Отличие интерференционного метода от метода фазового контраста заключается гл. обр. в возможности, используя компенсаторы, с высокой точностью (до 1/300 лямбда) измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Это открывает широкие возможности количественных исследований - на основании таких измерений могут быть рассчитаны общая масса и концентрация сухого вещества в микрообъекте (напр., в растит. или животной клетке), показатель преломления и размеры объекта (рис. 7). Метод интерференционного контраста часто сочетают с др. методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете; применение его совместно с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, напр., определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии обычно относят также методы использования микроинтерферометров.
Рис. 6.
Рис. 7. Микрофотография эритроцита человека в монохроматическом свете с X = 0,546 мкм. Изгиб интерференционной полосы воспроизводит в масштабе толщину эритроцита.
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается в наблюдении под М. зелено-оранжевого свечения микрообъектов, к-рое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами (см. Люминесценция). При этом методе в оптич. схему М. вводятся два светофильтра. Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, к-рые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо спец. красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через объектив, к-рый в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда наз. "люминесцентной микроскопией в отражённом свете" (этот термин условен - возбуждение свечения препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.
Метод широко применяется в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищ. пром-сти, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Обилие и разнообразие применений связаны с чрезвычайно высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелю-минесцирующем фоне, а также ценностью информации о составе и свойствах исследуемых веществ, к-рую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения.
Метод наблюдения в ультрафиолетовых (У Ф) л у-ч а х позволяет увеличить предельную разрешающую способность М., т. е. понизить его предельное разрешение, к-рое зависит (см. выше) от длины волны лямбда применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей лямбда = 400 - 250 нм, тогда как для видимого света лямбда = 700 - 400 нм). Но гл. обр. этот метод расширяет возможности микроскопич. исследований за счёт того, что частицы мн. веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, напр., ряд веществ, содержащихся в растит, и животных клетках (пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство витаминов, ароматич. аминокислоты, нек-рые липиды, тироксин и др.); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа.
Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электроннооптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространён след, способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (напр., синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.
Метод наблюдения в инфракрасных (И К) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электроннооптич. преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутр. структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, напр, тёмных стекол, нек-рых кристаллов и минералов и пр,
Микрофотографирование и м и к р ок и н о с ъ ё м к а, т.е. получение с помощью М. изображений на светочувствит. слоях, широко применяется в сочетании со всеми др. методами микроскопич. исследования. Оптич. система М. при микрофото- и микрокиносъёмке требует нек-рой перестройки -иной по сравнению с визуальным наблюдением фокусировки окуляра относительно изображения, даваемого объективом (подробнее об этом см. в ст. Микропроекция). Мн. совр. М. имеют постоянные (вмонтированные) устройства для микрофотографии, к-рые позволяют осуществлять такую перестройку и проектировать изображения препаратов на фотопластинку или плёнку (а большинство М. может быть с этой целью оснащено дополнит, принадлежностями). Микрофотография незаменима при документировании исследований, при изучении объектов в невидимых для глаза УФ и ИК лучах (см. выше), а также объектов со слабой интенсивностью свечения. Микрокиносъёмка важна при исследовании процессов, развёртывающихся во времени (жизнедеятельности тканевых клеток и микроорганизмов, роста кристаллов, протекания простейших хим. реакций и т. п.).
Основные узлы микроскопа. В большинстве типов М. (за исключением инвертированных, см. ниже) над предметным столиком, на к-ром закрепляют препарат, располагается устройство для крепления объективов, а под столиком устанавливается конденсор. Любой М. имеет тубус (трубку), в к-ром устанавливаются окуляры; обязательной принадлежностью М. являются также механизмы для грубой и точной фокусировки (осуществляемой путём изменения относит, положения препарата, объектива и окуляра). Все эти узлы крепятся на штативе или корпусе М.
Тип применяемого конденсора зависит от выбора метода наблюдения. Светлопольные конденсоры и конденсоры для наблюдения по методу фазового или интерференционного контраста представляют собой сильно отличающиеся одна от другой двух- или трёхлинзовые системы. У светлопольных конденсоров числовая апертура может достигать 1,4; в их состав входит апертурная ирисовая диафрагма, к-рая иногда может смещаться в сторону для получения косого освещения препарата. Фазово-контрастные конденсоры снабжены кольцевыми диафрагмами. Сложными системами из линз и зеркал являются темнопольные конденсоры. Отд. группу составляют эпи-конденсоры - необходимые при наблюдении по методу тёмного поля в отражённом свете системы кольцеобразных линз и зеркал, устанавливаемых вокруг объектива. В УФ микроскопии применяются спец. зеркально-линзовые и линзовые конденсоры, прозрачные для ультрафиолетовых лучей.
Объективы в большинстве совр. М. сменные и выбираются в зависимости от конкретных условий наблюдения. Часто неск. объективов закрепляются в одной вращающейся (т. н. револьверной) головке; смена объектива в этом случае осуществляется простым поворотом головки. По степени исправления хроматической аберрации различают микрообъективы ахроматы и апохроматы. Первые наиболее просты по устройству; хроматич. аберрация в них исправлена только для двух длин волн, и изображение при освещении объекта белым светом остаётся слегка окрашенным. В апохроматах эта аберрация исправлена для трёх длин волн, и они дают бесцветные изображения. Плоскость изображения у ахроматов и апохроматов несколько искривлена (см. Кривизна поля). Аккомодация глаза и возможность просмотра всего поля зрения с помощью перефокусировки М. отчасти компенсируют этот недостаток при визуальном наблюдении, однако он сильно сказывается при микрофотографировании - крайние участки изображения получаются нерезкими. Поэтому широко используют микрообъективы с дополнит, исправлением кривизны поля - планахро-маты и планапохроматы. В сочетании с обычными объективами применяют спец. проекционные системы-г о м а л и, вставляемые вместо окуляров и исправляющие кривизну поверхности изображения (для визуального наблюдения они непригодны).
Кроме того, микрообъективы различаются: а) по спектральным характеристикам - на объективы для видимой области спектра и для УФ и ИК микроскопии (линзовые или зеркально-линзовые); б) по длине тубуса, на к-рую они рассчитаны (в зависимости от конструкции М.),- на объективы для тубуса 160 мм, для тубуса 190 мм и для т. н. "длины тубуса бесконечность" (последние создают изображение "на бесконечности" и применяются совместно с дополнит.- т. н. тубусной - линзой, переводящей изображение в фокальную плоскость окуляра); в) по среде между объективом и препаратом - на сухие и иммерсионные; г) по методу наблюдения-на обычные, фазово-контрастные, интерференционные и др.; д) по типу препаратов - для препаратов с покровным стеклом и без него. Отд. тип представляют собой эпиобъективы (сочетание обычного объектива с эпиконденсором). Многообразие объективов обусловлено разнообразием методов микроскопич. наблюдений и конструкций М., а также различиями в требованиях к исправлению аберраций в разных условиях работы. Поэтому каждый объектив можно применять только в тех условиях, для к-рых он рассчитан. Напр., объективом, рассчитанным для тубуса 160 мм, нельзя пользоваться в М. с длиной тубуса 190 мм, с объективом для препаратов с покровным стеклом нельзя наблюдать препараты без покровного стекла. Особенно важно соблюдать расчётные условия при работе с сухими объективами больших апертур (А > 0,6), к-рые очень чувствительны ко всяким отклонениям от нормы. Толщина покровных стёкол при работе с этими объективами должна быть равна 0,17 мм. Иммерсионный объектив можно использовать только с той иммерсией, для к-рой он рассчитан.
Тип применяемого окуляра при данном методе наблюдения определяется выбором объектива М. С ахроматами малых и средних увеличений используют окуляры Гюйгенса, с апохроматами и ахроматами больших увеличений - т. н. компенсационные окуляры, рассчитываемые так, чтобы их остаточная хроматич. аберрация была другого знака, чем у объективов, что улучшает качество изображения. Кроме того, существуют спец. фотоокуляры и проекционные окуляры, к-рые проектируют изображение на экран или фотопластинку (сюда же можно отнести упомянутые выше гома-ли). Отд. группу составляют кварцевые окуляры, прозрачные для УФ лучей.
Разнообразные принадлежности к М. позволяют улучшить условия наблюдения и расширить возможности исследований. Осветители различных типов предназначены для создания наилучших условий освещения; окулярные микрометры служат для измерения размеров объектов; бинокулярные тубусы дают возможность наблюдать препарат одновременно двумя глазами; микрофотонасадки и микрофотоустановки применяются при микрофотографии; рисовальные аппараты дают возможность зарисовывать изображения. Для количеств, исследований применяются спец. устройства (напр., микроспектрофотометрич. насадки).
Типы микроскопов. Конструкция М., его оснащение и характеристики осн. узлов определяются либо областью применения, кругом проблем и характером объектов, для исследования к-рых он предназначен, либо методом (методами) наблюдения, на к-рые он рассчитан, либо же и тем и другим вместе. Всё это привело к созданию различных типов специализированных М., позволяющих с высокой точностью изучать строго определённые классы объектов (или даже только нек-рые определённые их свойства). С др. стороны, существуют т. н. универсальные М., с помощью к-рых можно различными методами наблюдать различные объекты.
Биологические М. относятся к числу наиболее распространённых. Они применяются для ботанич., гистоло-гич., цитологич., микробиологич., мед. исследований, а также в областях, не связанных непосредственное биологией,-для наблюдения прозрачных объектов в химии, физике и т. д. Существует много моделей биологич. М., отличающихся конструктивным оформлением и дополнит, принадлежностями, к-рые существенно расширяют круг изучаемых объектов. К этим принадлежностям относятся: сменные осветители проходящего и отражённого света; сменные конденсоры для работы по методам светлого и тёмного полей; фазово-контрастные устройства; окулярные микрометры; микрофотонасадки; наборы светофильтров и поляризационных устройств, позволяющие в обычном (неспециализированном) М. применять технику люминесцентной и поляризационной микроскопии. Во вспомогат. оборудовании для биологич. М. особенно важную роль играют средства микроскопической техники, предназначенные для подготовки препаратов и проведения с ними различных операций, в т. ч. и непосредственно в процессе наблюдения (см. Микроманипулятор, Микротом).
Биологич. исследовательские М. оснащаются набором сменных объективов для различных условий и методов наблюдения и типов препаратов, в т. ч. эпиобъ-ективами для отражённого света и зачастую фазово-контрастными объективами. Набору объективов соответствует комплект окуляров для визуального наблюдения и микрофотографирования. Обычно такие М. имеют бинокулярные тубусы для наблюдения двумя глазами.
Кроме М. общего назначения, в биологии широко используются и различные М., специализированные по методу наблюдения (см. ниже).
Инвертированные М. отличаются тем, что объектив в них располагается под наблюдаемым предметом, а конденсор - сверху. Направление хода лучей, прошедших сверху вниз через объектив, изменяется системой зеркал, и в глаз наблюдателя они попадают, как обычно, снизу вверх (рис. 8). М.
Рис. 8. Принципиальная оптическая схема инвертированного микроскопа.
Зеркала этого типа предназначены для исследования громоздких объектов, к-рые трудно или невозможно расположить на предметных столиках обычных М. В биологии с помощью таких М. изучают находящиеся в питательной среде культуры тканей, к-рые помещают в термоста-тирующую камеру для поддержания заданной темп-ры. Инвертированные М. применяют также для исследования хим. реакций, определения точек плавления материалов и в др. случаях, когда для осуществления наблюдаемых процессов требуется громоздкое вспомогат. оборудование. Для микрофотографирования и микрокиносъёмки инвертированные М. снабжают специальными устройствами и камерами.
Особенно удобна схема инвертированного М. для наблюдения в отражённом свете структур различных поверхностей. Поэтому она применяется в большинстве металлографических М. В них образец (шлиф металла, сплава или минерала) устанавливается на столике полированной поверхностью вниз, а остальная его часть может иметь произвольную форму и не требует к.-л. обработки. Существуют также металлографические М., в которых объект располагают снизу, закрепляя его на специальной пластине; взаимное положение узлов в таких М. то же, что и в обычных (неинвертированных) М. Изучаемая поверхность часто предварительно протравливается, благодаря чему зёрна её структуры становятся резко отличимыми друг от друга. В М. этого типа можно использовать метод светлого поля при прямом и косом освещении, метод тёмного поля и наблюдение в поляризованном свете. При работе в светлом поле объектив одновременно служит и конденсором. Для темнопольного освещения применяются зеркальные парабо-лич. эпиконденсоры. Введение спец. вспомогат. устройства позволяет осуществить фазовый контраст в метал-лографич. М. с обычным объективом (рис. 9).
Рис. 9. Микрофотографии нетравленого шлифа металла, снятые металлографическим микроскопом: а - в светлом поле; б - с фазово-контрастным устройством.
Люминесцентные М. оснащаются набором сменных светофильтров, подбирая к-рые можно выделить в излучении осветителя часть спектра, возбуждающую люминесценцию конкретного исследуемого объекта. Подбирается также светофильтр, пропускающий от объекта только свет люминесценции. Свечение мн. объектов возбуждается УФ лучами или коротковолновой частью видимого спектра; поэтому источниками света в люминесцентных М. служат дающие именно такое (и очень яркое) излучение ртутные лампы сверхвысокого давления (см. Газоразрядные источники света). Помимо специальных моделей люминесцентных М., имеются люминесцентные устройства, используемые совместно с обычными М.; они содержат осветитель с ртутной лампой, набор светофильтров и т. н. опак-иллюминатор для освещения препаратов сверху.
Ультрафиолетовые и инфракрасные М. служат для исследований в невидимых для глаза областях спектра. Их принципиальные оп-тич. схемы аналогичны схеме обычных М. Из-за большой сложности исправления аберраций в УФ и ИК областях конденсор и объектив в таких М. часто представляют собой зеркально-линзовые системы, в к-рых существенно уменьшается или полностью отсутствует хрома-тич. аберрация. Линзы изготовляются из материалов, прозрачных для УФ (кварц, флюорит) или ИК (кремний, германий, флюорит, фтористый литий) излучения. Ультрафиолетовые и инфракрасные М. снабжены фотокамерами, в к-рых фиксируется невидимое изображение; визуальное наблюдение через окуляр в обычном (видимом) свете служит, когда это возможно, лишь для предварит, фокусировки и ориентировки объекта в поле зрения М. Как правило, в этих М. имеются электроннооптич. преобразователи, превращающие невидимое изображение в видимое.
Поляризационные М. предназначены для изучения (с помощью оптич. компенсаторов) изменений в поляризации света, прошедшего через объект или отражённого от него, что открывает возможности количественного или полуколичественного определения различных характеристик оптически активных объектов. Узлы таких М. обычно выполняются так, чтобы облегчить точные измерения: окуляры снабжаются перекрестием , микрометрической шкалой или сеткой; вращающийся предметный столик - угломерным лимбом для измерения угла поворота; часто на предметном столике крепится Фёдорова столик, дающий возможность произвольно поворачивать и наклонять препарат для нахождения кристаллографич. и кристаллооптич. осей. Объективы поляризационных М. специально подбираются так, чтобы в их линзах отсутствовали внутр. напряжения, приводящие к деполяризации света. В М. этого типа обычно имеется включаемая и выключаемая вспомогат. линза (т. н. линза Бертрана), используемая при наблюдениях в проходящем свете; она позволяет рассматривать интерференционные фигуры (см. Кристаллооптика), образуемые светом в задней фокальной плоскости объектива после прохождения через исследуемый кристалл.
С помощью интерференционных М. наблюдают прозрачные объекты по методу интерференционного контраста; мн. из них конструктивно аналогичны обычным М., отличаясь лишь наличием спец. конденсора, объектива и измерит, узла. Если наблюдение производится в поляризованном свете, то такие М. снабжаются поляризатором и анализатором. По области применения (гл. обр. биологич. исследования) эти М. можно отнести к специализированным биологич. М. К интерференционным М. часто относят также микроинтерферометры - М. особого типа, применяемые для изучения микрорельефа поверхностей обработанных металлич. деталей.
Стереомикроскопы. Бинокулярные тубусы, используемые в обычных М., при всём удобстве наблюдения двумя глазами не дают стереоскопич. эффекта: в оба глаза попадают в этом случае под одинаковыми углами одни и те же лучи, лишь разделяемые на два пучка призменной системой. Стереомикроскопы, обеспечивающие подлинно объёмное восприятие микрообъекта, представляют собой фактически два М., выполненных в виде единой конструкции так, что правый и левый глаза наблюдают объект под разными углами (рис. 10). Наиболее широкое применение такие М. находят там, где требуется производить к.-л. операции с объектом в ходе наблюдения (биологического исследования, хирургич. операции на сосудах, мозге |
